Uji Penting PCR Di Udang

udang-vannameiDalam budidaya udang windu dan udang vannamei munculnya penyakit merupakan kerugian besar. Berbagai fakta di lapangan memperlihatkan wabah penyakit akibat infeksi bakteri, cendawan, dan virus menyebabkan terganggunya proses budidaya karena dapat menyebabkan kematian massal.

Beberapa virus yang menyerang udang di tambak adalah White Spot Syndrome Virus (WSSV) dan Taura Syndrome Virus (TSV). Nah, infeksi virus dapat dideteksi dengan cepat dan akurat dengan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) atau reaksi rantai polimerase.

Teknik tersebut sebenarnya bukan barang baru, tapi pemanfaatannya dalam dunia akuakultur belum begitu lama karena tidak populer lantaran harga peralatannya relatif mahal. Namun sesungguhnya pembudidaya tidak perlu memiliki PCR sendiri, karena banyak balai-balai perikanan milik pemerintah dan swasta yang memiliki program pengujian PCR.

Prinsip kerja uji PCR adalah mengekstraksi DNA/RNA dari sampel. Berikutnya memperbanyak potongan-potongan DNA/RNA yang membawa informasi genetika tertentu, dan sebagai langkah terakhir adalah proses elektroforesis untuk melihat hasil produk PCR. Sampel yang diuji PCR sebaiknya dalam kondisi segar. Namun bila tidak memungkinkan sampel dapat disimpan dalam larutan alkohol 95%  (perbandingan 1: 9,  1 bagian sampel dengan 9 bagian alkohol 95%) untuk kemudian dikirim ke laboratorium.

Langkah tersebut dapat mencegah terjadinya kerusakan DNA/RNA. Untuk udang, sampel yang diambil biasanya berupa potongan insang, kaki renang (pleopoda), atau cairan hemolim, sedangkan dari ikan, misalnya, dapat memakai potongan mata dan otak (uji VNN) dan insang. Di laboratorium, sampel harus segera diekstraksi. Proses tersebut dilakukan dengan memakai larutan Lysis Buffer (IQ2000 TM).

DNA diekstrak dari sel-sel sampel untuk kemudian diamankan dari kerusakan akibat kerja enzim dNase. Selanjutnya ekstrak  disentrifus sehingga diperoleh butiran/pelet DNA, yang akan dipakai dalam tahap kedua proses uji PCR.  Untuk mengekstrak RNA digunakan RNA Extraction Solution (IQ2000 TM), yang sekaligus akan mengamankan RNA dari kerusakan akibat kerja enzim rNase.

Hasil ekstraksi DNA/RNA pada tahap pertama tersebut lantas digandakan dengan  bantuan enzim-enzim yang dikenal sebagai primer. Satu jenis primer bertanggung jawab atas penggandaan satu jenis DNA/RNA tertentu, sehingga primer WSSV hanya bisa dipakai untuk uji WSSV. Demikian seterusnya. Proses penggandaan DNA/RNA dengan bantuan enzim-enzim ini dikenal sebagai proses amplifikasi yang dilakukan pada kondisi suhu dan siklus penggandaan tertentu, yang dapat diatur pada  thermocycle.  Alat itu disebut sebagai mesin PCR.

Oleh sebab siklus penggandaan yang berulang, maka seolah-olah kegiatan ini merupakan suatu proses reaksi berantai, dan karena proses ini memakai enzim  DNA Taq Polymerase, maka keseluruhan prosesnya dipanggil sebagai Polymerase Chain Reaction atau reaksi rantai polimerase. Hasil produk PCR selanjutnya digunakan pada tahap ketiga, yaitu proses elektroforesis.

Dengan bantuan larutan Buffer TAE atau TBE, DNA/RNA yang telah diklon pada tahap kedua dimasukkan ke dalam lubang-lubang kecil yang terdapat pada lempengan agar Agarose 2%. Hasil proses elektroforesis akan menampilkan pita-pita DNA/RNA yang letaknya tersebar tergantung pada berat molekul untuk selanjutnya dibandingkan dengan posisi pita-pita pada lajur penanda DNA (DNA Marker).  Berdasarkan pembacaan hasil pada tahap ketiga tersebut bisa disimpulkan sampel bebas dari infeksi virus atau tidak.

pcr-udangUntuk menjamin akurasi data dan proses kerja, setiap kali pengujian PCR harus disertai dengan kontrol positif dan kontrol negatif.  Kontrol positif memakai plasmid DNA/RNA virus yang diuji, sehingga pada lempengan agar setelah dielektroforesis harus terdapat pita-pita DNA/RNA.

Sebaliknya, kontrol negatif memakai air biasa sebagai kontrol, sehingga pada lempengan agar setelah dielektroforesis harus bersih atau kosong.  Apabila terdapat pita-pita DNA/RNA pada lajur kontrol negatif, hal ini mengindikasikan adanya kontaminasi, sehingga keseluruhan proses uji harus diulang untuk menjamin keakuratan hasil.

Keberhasilan pengujian sampel dengan metode PCR dipengaruhi oleh beberapa hal, seperti faktor kontaminasi silang, umur reagen/enzim yang dipakai, jumlah enzim yang dipakai, ketelitian saat proses ekstraksi, kondisi larutan buffer dan larutan etidium bromida yang dipakai.

Hasil uji PCR dapat berupa data kualitatif ataupun kuantitatif.  Data kualitatif hanya menunjukkan ada atau tidaknya infeksi virus, sedang data kuantitatif dapat menunjukkan tingkat infeksi virus yang terjadi pada sampel yang diuji, baik infeksi ringan, infeksi medium, ataupun infeksi berat.

Dengan demikian dapat segera diambil tindakan yang dipermemutuskan langkah-langkah yang harus diambil, misalnya segera mengisolasi bak atau petak tambak dan kolam yang terinfeksi dengan memperbaiki sanitasi lingkungan, pemberian imunostimulan bagi udang untuk meningkatkan daya tahan tubuh, atau segera memusnahkan udang sehingga tidak menulari petak kolam yang bebas infeksi.  Dengan langkah tersebut dapat meminimalisir kerugian.

Pengujian PCR dapat pula digunakan saat menyeleksi benur yang akan ditebar di tambak. Dengan cara tersebut diperoleh benur berkualitas bebas virus. Untuk mengantisipasi terjadinya infeksi penyakit seyogyanya perlu dilakukan pengujian sampel secara berkala pada hari ke-30, 60, dan 90 pascatebar benur.

Hasil uji PCR dapat diketahui dalam waktu 5-6 jam, relatif cepat dan akurat untuk mendeteksi infeksi virus atau penyakit lain. Beberapa balai perikanan yang menerima uji PCR adalah BPBAP Bangil dan BBAP Situbondo (Jawa Timur), BBRPBL Gondol (Bali), BBPBAP Jepara, dan BBL Lampung.

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *

46 − 44 =